Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang
tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.[1]
Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.[2]
Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.[1][2]
Spektrofotometri terdiri dari
beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah
sebagai berikut:
1. Spektrofotometri Vis (Visible)
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)
3. Spektrofotometri UV-Vis
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis
Spektrofotometri terdiri dari
beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah
sebagai berikut:1. Spektrofotometri Vis (Visible)
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)
3. Spektrofotometri UV-Vis
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis
Pada spektrofotometri ini yang
digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible
termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia.
Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar
yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun..
selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar
tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.
Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.
Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
3. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.
Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.
Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
3. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.
pektrofotometri merupakan suatu
metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis
oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan
menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.
Spektrofotometer adalah alat untuk
mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang
gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang
digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Spektrofotometri dapat dianggap
sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam
dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai
panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum
tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.
Absorbsi
sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :
A
= log ( Io / It
) = a b c
Keterangan
: Io = Intensitas sinar datang
It
= Intensitas sinar yang diteruskan
a
= Absorptivitas
b
= Panjang sel/kuvet
c
= konsentrasi (g/l)
A
= Absorban
Spektrofotometri merupakan bagian
dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :
1. Daerah jangkauan spektrum
Filter fotometr hanya dapat
digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan
spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm)
maupun IR (> 750 nm).
2. Sumber sinar
Sesuai dengan daerah jangkauan
spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada
masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter
fotometer hanya untuk daerah tampak.
3. Monokromator
Filter fotometere menggunakan filter
sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya
resolusinya lebih baik.
4. Detektor
- Filter fotometer
menggunakan detektor fotosel
- Spektrofotometer
menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.
Komponen utama dari spektrofotometer
yaitu :
1. Sumber
cahaya
Untuk radisi kontinue :
-
Untuk daerah UV dan daerah tampak :
-
Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang
320-2500 nm.
-
Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm)
-
Lampu gas xenon (250-600 nm)
Untuk daerah IR
Ada tiga macam sumber sinar yang
dapat digunakan :
-
Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida (38%)
dan erbiumoxida (3%)
-
Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).
-
Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 – 20 nm
- Spektrum
radiasi garis UV atau tampak :
-
Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa)
-
Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga
-
Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp)
-
Laser
2.
Pengatur Intensitas
Berfungsi untuk mengatur intensitas
sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan.
3.
Monokromator
Berfungsi untuk merubah sinar
polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran
Macam-macam monokromator :
- Prisma
- kaca untuk daerah
sinar tampak
- kuarsa untuk daerah UV
- Rock salt (kristal
garam) untuk daerah IR
- Kisi difraksi
Keuntungan menggunakan kisi :
- Dispersi sinar merata
- Dispersi lebih baik
dengan ukuran pendispersi yang sama
- Dapat digunakan dalam
seluruh jangkauan spektrum
4. Kuvet
Pada pengukuran di daerah sinar
tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal
garam untuk daerah IR.
5.
Detektor
Fungsinya untuk merubah sinar
menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur.
Syarat-syarat ideal sebuah detektor
:
-
Kepekan yang tinggi
-
Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
-
Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
-
Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
-
Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
- Detektor foto
(Photo detector)
- Photocell
- Phototube
- Hantaran
foto
- Dioda
foto
- Detektor
panas
6. Penguat
(amplifier)
Berfungsi untuk memperbesar arus
yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator.
7.
Indikator Dapat berupa :
-
Recorder
-
Komputer
Tidak ada komentar:
Posting Komentar